DNA 構造解析における電子-電子二重共鳴 (DEER) - EPR (ESR) アプリケーション

ワトソンとクリックが DNA の古典的な二重らせん構造を提案した 1950 年代以来、DNA は生命科学研究の中心となってきました。DNA中の4つの塩基の数とその並び順が遺伝子の多様性を生み出し、その空間構造が遺伝子発現に影響を与えます。

伝統的な DNA 二重らせん構造に加えて、研究により、人間の細胞には特別な 4 本鎖 DNA 構造である G 四重鎖が同定されています。G 四重鎖は、グアニン (G ）、これは急速に分裂する細胞（例えば、癌細胞）に特に多く存在する。したがって、G-四重鎖は抗がん研究における薬剤標的として使用できます。G 四重鎖の構造と結合剤へのその結合様式の研究は、がん細胞の診断と治療にとって重要です。

G-quadruplex の三次元構造の概略図。
画像出典：ウィキペディア

電子-電子二重共鳴 (DEER)

パルス双極子 EPR (PDEPR) 法は、構造生物学および化学生物学における構造決定のための信頼性が高く汎用性の高いツールとして開発され、PDEPR 技術によってナノスケールでの距離情報を提供します。G 四重鎖構造の研究では、部位特異的スピン標識 (SDSL) と組み合わせた DEER 技術により、異なる長さの G 四重鎖二量体を区別し、二量体に対する G 四重鎖結合剤の結合パターンを明らかにすることができます。

DEER 技術を使用した異なる長さの G 四重鎖二量体の

識別距離測定用のスピンラベルとして Cu(ピリジン)4 を使用すると、正方晶平面状の Cu(ピリジン)4 錯体が G 四重鎖に共有結合し、2 つの常磁性 Cu2+ 間の距離が測定されました。ダイマー形成を研究するために、双極子間相互作用を検出することによって、π スタック G 四級モノマーの α が測定されました。

[Cu2+@A4] (TTLGGG) および [Cu2+@B4] (TLGGGG) は、異なる配列を持つ 2 つのオリゴヌクレオチドであり、L はリガンドを示します。[Cu2+@A4]2 および [Cu2+@B4]2 の DEER 結果を図 1 および図 2 に示します。 DEER 結果から、[Cu2+@A4]2 二量体では、単一の二量体の平均距離がCu2+ -Cu2+ は dA=2.55 nm、G-quadruplex 3' 末端はテール-テイルスタッキングにより G-quadruplex ダイマーを形成し、G-quadruplex ダイマー中の 2 つの Cu2+ スピンラベルの gz 軸は平行に並んでいます。

[Cu2+@A4]2 π 積層距離は、[Cu2+@A4]2 ダイマーと比較して長い (dB-dA = 0.66 nm)。各 [Cu2+@B4] モノマーには追加の G テトラマーが含まれていることが確認され、その結果は予想される距離と完全に一致しています。したがって、DEER 技術による距離測定により、異なる長さの G 四重鎖二量体を区別できます。

図 1 (A) [Cu2+@A4]2 二量体のパルス EPR 微分スペクトル (黒線) とその対応するシミュレーション (赤線) (34 GHz、19 K)。(B) バックグラウンド補正後、フィールド位置の DEER 時間領域マップ (黒線) と PeldorFit から得られた最良の適合結果 (赤線) の 4 つのフェーズ。(C) PeldorFit (赤線) と MD シミュレーション (灰色の線) を使用して取得された距離分布。(D) [@A4] モノマーと [Cu2+@A4]2 ダイマー間の [Cu2+ 平衡]。(Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

図 2 (A) [Cu2+@B4]2 バックグラウンド補正後の 4 つのフィールド位置での DEER 時間領域図 (黒線) と PeldorFit から得られた最良の適合結果 (赤線)。(B) [Cu2+@B4]; (C) PeldorFit (赤線) と MD シミュレーション (灰色の線) を使用して取得された距離分布。(Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

DEER技術を使用したG-テトラマー結合剤のダイマーへの結合モードの探索

平面芳香族共役系と正電荷を持つ多くの小分子や金属錯体は、折り畳まれた二次構造を結合して安定化させることができるため、抗がん剤となる可能性があります。
N,N' -ビス[2-(1-ピペリジニル)エチル]3,4,9,10-ペリレンテトラカルボキシジカルボニル塩酸塩 (PIPER) は、スタッキングによって四重鎖に結合して安定化できるよく知られた G-四重鎖結合剤です。 PIPER の G-quadruplex への結合モードは DEER 技術によって調べることができます。

図 3 と図 4 は、異なる PIPER 対 [Cu2+@A4]2 二量体比での DEER 実験の結果を示しています。結果は、PIPER と [Cu2+@A4]2 二量体比が 1:1 (PIPER@[Cu2+@A4]2) の場合、dP = 2.82 nm であることを示しています。
純粋な [Cu2+@A4]2 二量体 (dA = 2.55 nm) と比較して Cu2+-Cu2+ 間の距離が増加していることは、PIPER が二量体とサンドイッチ複合体を形成し、平面状有機分子が 2 つの G の 3' 面の間に介在していることを示しています。四量体モノマー。PIPER と [Cu2+@A4]2 ダイマーの比が 2:1 (2PIPER@[Cu2+@A4]2) の場合、d2P = 3.21 nm。
PIPER@[Cu2+@A4]2 ダイマー ( dP = 2.82 nm ) と比較して追加の π スタッキング距離は、テールツーテールに配置された G テトラマー ダイマーへの 2 つの PIPER リガンドの挿入を示します。DEER 技術は、G 四量体結合剤 PIPER を G 四量体二量体に挿入して挿入複合体を形成する新しい結合様式を明らかにすることができます。

図 3 (A) PIPER と [Cu2+@A4]2 ダイマーの比率が異なる場合の DEER 双極子スペクトル (geff =2.061)。(B) 異なる比率の PIPER と [Cu2+@A4]2 ダイマー深度による DEER 変調。(C) [Cu2+@A4]2 二量体と PIPER@[Cu2+@A4]2、2PIPER@[Cu2+@A4]2、PIPER@[Cu2+@A4] の平衡。
(Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

図 4 (A) PIPER@[Cu2+@A4]2 の DEER 時間領域スペクトル。(B) PeldorFit (赤線) と MD シミュレーション (灰色の線) を使用して取得した PIPER@[Cu2+@A4]2 距離分布。(C) 2PIPER@[Cu2+@A4]2 の DEER 時間領域スペクトル。(D) PeldorFit (赤線) と MD シミュレーション (灰色の線) を使用して取得した 2PIPER@[Cu2+@A4]2 距離分布。
(Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

CIQTEK パルス電子常磁性共鳴分光計

CIQTEK パルス電子常磁性共鳴分光計 EPR100 は二重電子-電子共鳴技術をサポートしており、複雑な膜タンパク質、DNA、RNA、核酸-タンパク質の構造局在化、機能解釈、生理学的運動プロセス、および作用機序の解釈を研究するために使用できます。複合体、およびさまざまな疾患において重要な役割を果たす関連タンパク質分子。

CIQTEK パルス電子常磁性共鳴分光計 EPR100


CIQTEK EPR100 の DEER 実験結果

DeerAnalysis で処理した実験結果